药物杂质对照品纯化分离方法通常包括：结晶法、柱层析法、制备薄层色谱法、制备色谱法和成盐法、酸碱法等。由于药物杂质对照品粗品的获得过程，往往含量较低。因而本文主要讨论制备色谱法在分离纯化中的应用。

2.1 结晶法

常用的结晶法有冷却结晶法和反溶剂结晶法。冷却结晶法是根据物质在某一溶剂不同温度下溶解度不同，将待纯化物加热至溶解后，降温析晶的过程。冷却结晶关键在于溶剂的选择，通常根据“相似相容”原理。而反溶剂结晶法指的是选取两种溶剂（良性溶剂和不良溶剂），将待纯化产物溶于良性溶剂再加入不良溶剂析晶的过程。结晶法主要适用于杂质含量比较高的产品（例如定向合成），本文不做重点讨论。

2.2 柱层析法

柱层析法即常说的“过柱子”，分离原理是根据物质在固定相上的吸附能力不同而进行分离，常用的吸附固定相是硅胶和氧化铝，分离的关键在于装柱方法（湿法和干法），上样方法（湿法和干法）和洗脱剂的选择（溶剂选择和洗脱方式）。柱层析法具有能耗低、洗脱剂易于回收等优点，同时也存在分离过程费时、效率低，对于复杂化合物纯化效果差等缺点。

2.3 制备薄层色谱法

制备薄层色谱法（爬大板法）可以快速分离反应体系混合物的多种成分，是一种实用快速获取少量对照品的方法。制备薄层色谱法操作流程主要包括：硅胶板的选择（通常自制、厚度好）、样品上样、洗脱展开、色带检测、刮板溶解。制备薄层色谱法虽然操作方便，设备简单，但仍存在样品处理量小的缺点。

2.4 制备液相色谱法

制备液相色谱法是一种具有高灵敏度、高选择性的快速分离技术，其目的是对产品进行快速分离纯化。在纯度、收率、分离效率等方面远优于传统的制备方法，已广泛地应用于药物研究的分离和纯化。